Metabolic engineering of Aspergillus niger via ribonucleoprotein-based CRISPR–Cas9 system for succinic acid production from renewable biomass - 논문 리뷰
본 논문은 산업용 미생물 Aspergillus niger를 대상으로 유전자 조작을 통해 지속가능한 바이오 기반의 숙신산(succinic acid)을 생산하는 연구에 관한 것이다. 숙신산은 다양한 화학제품의 원료로 사용될 수 있는 유망한 바이오 기반 화합물이며, 이를 석유 대신 재생 가능한 바이오매스로부터 생산할 수 있다면 환경적·경제적 이점이 크다. 본 연구는 CRISPR–Cas9 시스템 중에서도 특히 리보핵단백질(RNP) 기반의 시스템을 사용하여 A. niger의 유전자를 효율적으로 조작함으로써 숙신산 생산성을 획기적으로 향상시켰다. 두 가지 부산물인 글루콘산과 옥살산의 생성을 차단하고, 효율적인 C4-디카르복실산 수송체와 NADH-의존성 푸마르산 환원효소를 과발현시킴으로써, 새로운 변형 균주 SAP-3는 기존 균주에서는 생산되지 않던 수준의 숙신산을 생산할 수 있게 되었다. 또한 다양한 배양 조건(온도, pH) 및 재생 가능한 바이오매스(사탕무 당밀, 밀짚 가수분해물)를 활용한 실험을 통해 실용 가능성도 검증하였다.
연구 배경 및 중요성
화석연료 기반 화학산업의 지속 가능성 문제는 기후 변화와 환경 오염이라는 세계적 위기를 야기하고 있으며, 이에 대한 대안으로 바이오 기반 화학물질 생산이 주목받고 있다. 숙신산은 다양한 산업용 화합물(예: 1,4-부탄디올, 생분해성 폴리머)의 전구체로 활용될 수 있는 플랫폼 화합물로, 그 수요가 점점 증가하고 있다. 현재 미생물을 이용한 숙신산 생산은 상업화 단계에 진입했지만 여전히 높은 생산 비용과 효율성의 한계로 인해 널리 보급되지는 못하고 있다. 따라서, 고생산성 균주 개발이 숙신산 생산 경제성을 개선하는 핵심 과제로 대두되고 있다. A. niger는 유기산 생산에 특화된 산업균으로 다양한 기질을 사용할 수 있고, 낮은 pH에서도 생존 가능하여 매우 유리한 생산 플랫폼으로 간주된다.
연구 목적 및 배경
기존의 연구에서는 박테리아나 효모를 이용한 숙신산 생산이 주를 이루었지만, 그 한계로 인해 A. niger와 같은 진균 기반 플랫폼에 대한 관심이 커지고 있다. 그러나 A. niger에서는 숙신산 생산이 잘 이루어지지 않았으며, 그 이유로는 효율적인 대사 경로 확보와 유기산 분비 메커니즘의 불명확성이 있었다. 본 연구의 목적은 A. niger를 대상으로 효율적인 숙신산 생산이 가능하도록 유전자 조작을 수행하고, 이를 통해 최적의 배양 조건과 바이오매스를 찾는 것이다.
연구 방법
- RNP 기반 CRISPR–Cas9 시스템을 활용한 유전자 조작
- 글루콘산(gox)과 옥살산(oah) 생산 유전자 제거
- 고효율 C4-디카르복실산 수송체(AcDCT) 과발현
- NADH-의존성 푸마르산 환원효소(frd) 유전자 삽입
- 최적 배양 조건 탐색 (온도, pH)
- 두 종류의 재생 가능 바이오매스를 사용한 생산 실험
본 연구에서는 기존의 Plasmid 기반 시스템보다 오프 타겟이 적고 유연한 조작이 가능한 RNP 기반 CRISPR–Cas9 시스템을 사용했다. 이를 통해 단계적인 유전자 변형과 과발현을 수행하여 숙신산 생성 경로를 강화했다. 이어서 숙신산 생성량을 비교 분석하고 최적 배양 조건을 도출하였다.
주요 발견 및 결과
가장 핵심적인 결과는 변형된 SAP-3 균주가 기존의 야생형 균주에서는 검출되지 않던 숙신산을 최대 23 g/L까지 생산할 수 있게 되었다는 것이다. 특히 AcDCT와 frd 유전자 도입의 시너지 효과가 뚜렷하게 나타났다. 또한 온도는 35도에서, pH는 5.5일 때 숙신산 생산량이 가장 높았으며, 이는 기존 citric acid 생산에 최적인 저온·저pH 조건과는 다른 결과였다.
실험 결과 요약
| 균주 | 숙신산 생산량 (g/L) | 기타 산 생성량 | 탄수화물 소비 |
|---|---|---|---|
| 야생형 | 0 | 글루콘산 0.53 g/g | 완전 소비 |
| SAP-1 | 0.99 | 말산 ↑ | 낮음 |
| SAP-2 | 5.2 | 말산 ↑↑ | 중간 |
| SAP-3 | 17 (글루코스) / 23 (당밀) / 9 (밀짚) | 말산 ↓, 시트르산 유사 | 빠름 |
표에서 보이듯, SAP-3 균주는 기존 균주들과 비교하여 숙신산 생산량이 월등히 높았으며, 특히 당밀 같은 산업 부산물을 이용할 때도 높은 효율을 보였다.
한계점 및 향후 연구 방향
본 연구의 주요 한계는 낮은 pH 조건에서 숙신산 생산이 거의 이루어지지 않았다는 점이다. 이는 A. niger의 장점 중 하나인 저pH 내성에 비해 숙신산 생성 효소의 활성이 제한적이기 때문이다. 또한, 리보핵단백질 기반 시스템은 selection marker가 없기 때문에 공동 전달 효율이 낮고 정확한 유전자 편집 효율도 낮은 편이다. 향후 연구에서는 pH 반응성 유전자 조절 기전을 규명하고, 숙신산 경로에 특화된 pH-불변적 대사 효소를 발굴하는 것이 필요하다.
결론
본 연구는 A. niger를 바이오 기반 숙신산 생산의 새로운 플랫폼으로 전환시키기 위한 중요한 시도였다. RNP 기반 CRISPR–Cas9 기술을 성공적으로 적용해 효율적인 대사 경로를 구축하고, 환경 조건과 기질 최적화를 통해 상업적 응용 가능성을 높였다. 특히 당밀을 활용한 고효율 생산은 산업적 파급력이 크며, 향후 기술 개선을 통해 경제성과 환경성 모두를 만족시킬 수 있을 것이다.
개인적인 생각
A. niger는 유기산 생산의 대표주자이지만, 숙신산에 대해서는 그 가능성이 검증되지 않았다. 이 논문은 그러한 한계를 극복하고 진정한 대사공학의 진수를 보여준 사례다. 특히 C4-디카르복실산 수송체와 환원효소를 동시에 조작하여 탄소 흐름을 조정하는 방식은 매우 정교했다. 개인적으로는 이 연구가 보여준 유전자 편집 기술의 활용도, 환경 조건의 조정, 기질 선택까지 모든 면에서 실험 설계가 치밀했다고 느낀다. 향후 숙신산뿐만 아니라 다른 고부가 유기산 생산에도 이 시스템이 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
자주 묻는 질문(QnA)
- Q: 왜 A. niger를 선택했나요?
A: A. niger는 다양한 유기산 생산 경험이 있고, 저렴한 기질에서도 잘 자라며 낮은 pH에도 견디기 때문에 산업적으로 유리합니다. - Q: RNP 기반 CRISPR–Cas9 시스템의 장점은 무엇인가요?
A: 오프타겟이 적고, 구성 요소의 농도를 정밀하게 조절할 수 있어 정확한 유전자 편집이 가능합니다. - Q: 숙신산은 어떤 산업에 사용되나요?
A: 생분해성 플라스틱, 고분자, 접착제, 의약품 등의 전구체로 사용됩니다. - Q: 왜 pH 5.5가 최적인가요?
A: 낮은 pH에서는 숙신산 관련 효소 활성이 억제되며, 5.5에서는 효소가 가장 활발히 작용하는 것으로 보입니다. - Q: 당밀이 좋은 기질인 이유는?
A: A. niger가 당밀 내 탄수화물을 효율적으로 분해·활용할 수 있고, 비용도 저렴하기 때문입니다. - Q: 향후 어떤 기질을 추가로 검토할 수 있을까요?
A: 옥수수 전분, 사탕수수 폐기물, 식품 공정 부산물 등 다양한 농산폐기물이 후보가 될 수 있습니다.
용어 설명
- CRISPR–Cas9: 유전자 편집 기술로, 특정 DNA를 절단해 변형할 수 있는 도구
- RNP (Ribonucleoprotein): 리보핵단백질 복합체로 Cas9 단백질과 gRNA가 결합된 형태
- Succinic acid: C4 유기산으로, 다양한 화학 제품의 전구체
- AcDCT: Aspergillus carbonarius에서 유래한 C4 디카르복실산 수송 단백질
- FRD: Fumarate reductase, 푸마르산을 숙신산으로 환원하는 효소
- gRNA: 유전자 편집의 목표 위치를 안내하는 RNA
- Homologous recombination: 상동 재조합, DNA 수리 과정에서 유전물질이 교환되는 현상
- pH: 수소이온 농도를 나타내는 척도, 산성도와 관련
- Molasses: 사탕무나 사탕수수 가공 후 남는 당밀, 산업용 부산물
- Wheat straw hydrolysate: 밀짚을 가수분해하여 얻은 당 성분이 포함된 액체 기질