The generation of metabolic changes for the production of high-purity zeaxanthin mediated by CRISPR-Cas9 in Chlamydomonas reinhardtii - 리뷰

이 논문은 Chlamydomonas reinhardtii라는 녹조류 모델 생물을 대상으로 고순도 제악산틴(zeaxanthin)을 생산하기 위한 대사경로 변형 연구를 다루고 있다. 제악산틴은 시력 보호 및 항산화 기능을 갖는 황색 색소로, 최근에는 개인 맞춤형 영양제나 제약 분야에서 수요가 급격히 증가하고 있다. 본 연구는 CRISPR-Cas9 기술을 활용하여 zeaxanthin의 전구체인 루테인의 생합성을 차단하고, 오직 zeaxanthin만을 고순도로 생산하는 돌연변이주를 생성하였다. 특히, zeaxanthin epoxidase(ZEP)와 lycopene epsilon cyclase(LCYE) 유전자를 동시에 제거한 더블 녹아웃 돌연변이주(dzl)를 개발하고, 이로 인해 zeaxanthin의 생산성과 정제 효율을 모두 높일 수 있었다. 또한 배지 성분 최적화를 통해 생산성을 극대화하는 전략도 함께 제시하였다.

연구 배경 및 중요성

제악산틴은 시각 건강과 밀접한 관련이 있는 황색 색소로, 특히 중심망막부위의 광수용체를 청색광으로부터 보호하는 역할을 한다. 이 성분은 노화에 따른 황반변성 예방에 도움을 줄 수 있어, 고령화 사회에 접어든 현대에서 그 중요성이 더욱 부각되고 있다. 하지만 기존의 식물 기반 zeaxanthin 생산 방식은 정제 효율이 낮고 생산 단가가 높아, 산업적 생산에는 한계가 존재했다. 이에 따라 미세조류를 활용한 고효율 생산 방법이 대안으로 떠오르고 있으며, 특히 유전공학 기법을 통한 선택적 대사 조절은 고순도 제품 생산을 가능하게 한다는 점에서 주목을 받고 있다.

연구 목적 및 배경

이 연구의 핵심 목적은 Chlamydomonas reinhardtii를 유전자 조작을 통해 zeaxanthin만을 고순도로 생산할 수 있는 균주로 개량하는 것이다. 기존 ZEP 돌연변이주는 zeaxanthin과 lutein을 동시에 축적해 정제가 어려웠으며, lycopene으로부터의 대사 흐름이 α-카로틴(루테인의 전구체)과 β-카로틴(zeaxanthin의 전구체)로 나뉘는 점도 생산성 저하의 원인이었다. 이를 해결하기 위해 본 연구에서는 ZEP에 더해 LCYE 유전자도 제거하여 α-branch를 차단하고, zeaxanthin으로의 대사 흐름을 집중시켰다.

연구 방법

• DNA-free CRISPR-Cas9 RNP 시스템을 활용하여 ZEP 및 LCYE 유전자 녹아웃 수행
• Mutant 선별 및 Sanger 시퀀싱 및 Southern blot으로 돌연변이 확인
• 3종의 더블 녹아웃(dzl) 돌연변이 생성 및 zeaxanthin 생산량 비교
• 배지 조성 최적화를 통한 생산성 향상 실험

본 연구는 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP)을 활용한 DNA-free 방식으로 유전자 녹아웃을 수행하였다. zeaxanthin epoxidase 유전자가 먼저 제거된 ZEP 돌연변이주를 기반으로, lycopene epsilon cyclase(LCYE)를 추가로 타겟하여 더블 녹아웃 돌연변이(dzl)를 제작하였다. Southern blot 분석으로 유전자 삽입 여부를 확인하였으며, pigment 생산성과 세포 성장을 기준으로 최적 균주(dzl1)를 선정하였다. 이어서, 질소, 인산, 아세트산 농도를 조정한 최적 배지(Opt2)를 설계해 zeaxanthin 생산량을 극대화하였다.

주요 발견 및 결과

연구 결과, ZEP/LCYE 더블 녹아웃 균주인 dzl은 zeaxanthin만을 주로 생산하며, 기존 ZEP 돌연변이주보다 약 60% 높은 수율을 보였다. 고광 조건에서도 lutein, violaxanthin, neoxanthin이 없는 상태에서 생존 및 성장에 큰 문제가 없었으며, 저광 조건에서는 오히려 zeaxanthin 생산성이 더 높았다. 또한, 최적화된 배지에서는 3일 배양 시 zeaxanthin 수율이 기존 TAP 배지보다 약 30% 증가하였다.

실험 결과 요약

배양 조건	Zeaxanthin 수율 (mg/L)	Biomass (g/L)	Zeaxanthin 함량 (mg/g DCW)
TAP 배지	5.24	0.71	7.28
Opt2 배지	6.84	1.27	5.40

TAP 배지보다 Opt2 배지에서 biomass는 증가했지만, zeaxanthin 함량은 다소 감소하였다. 이는 세포 내 총 색소 함량 한계로 인해 농도가 희석된 결과로 해석된다. 하지만 전체 수율 측면에서는 Opt2 배지가 더 우수했다.

한계점 및 향후 연구 방향

dzl 돌연변이주는 zeaxanthin을 고순도로 생산할 수 있지만, 세포 내 총 카로티노이드 풀 자체를 확대하는 데는 한계가 있다. 따라서 향후 연구에서는 zeaxanthin의 전구체 공급 경로를 강화하기 위한 대사공학 전략, 예를 들어 PSY, DXS, DXR 유전자의 과발현을 통한 전구체 증대 전략이 필요하다. 또한, 고광 조건에서도 생장 속도 저하를 완화할 수 있는 보완적인 유전자 조절 전략도 병행되어야 할 것이다.

결론

본 연구는 Chlamydomonas reinhardtii를 유전자 조작하여 zeaxanthin만을 고순도로 생산할 수 있는 균주를 개발한 첫 사례로, 산업적 응용 가능성을 보여준다. CRISPR-Cas9 RNP 기반의 정밀한 유전자 편집을 통해 zeaxanthin의 선택적 생산이 가능해졌으며, 최적화된 배양 조건을 통해 수율까지 향상시켰다. 이는 개인 맞춤형 영양제나 약물용 색소 생산에 있어 매우 중요한 기술적 진보이다.

개인적인 생각

이 논문은 단순히 zeaxanthin 생산성을 높이는 데서 그치지 않고, downstream process까지 고려한 전략이 포함된 점에서 매우 인상 깊다. 기존의 색소 정제 과정에서 가장 큰 걸림돌이었던 루테인의 존재를 유전자 조작으로 완전히 제거하고, zeaxanthin의 선택적 축적을 유도함으로써 정제 효율까지 향상시킨 점이 매우 혁신적이다. 특히, 배지 성분 조절을 통해 mixotrophic 조건에서 생산성을 끌어올린 실험 설계는 실용적인 응용 가능성을 높였다. 향후 DXS, PSY 등의 전구체 공급 경로에 대한 대사공학까지 결합된다면, dzl 균주는 상용화를 위한 매우 강력한 후보가 될 것이다.

자주 묻는 질문(QnA)

• Q: zeaxanthin과 lutein의 구조 차이는 무엇인가요?
  A: zeaxanthin은 β,β-carotene-3,3′-diol 구조이고, lutein은 β,ε-carotene-3,3′-diol 구조로, ε-고리가 포함된 점에서 다릅니다.
• Q: dzl 균주는 어떻게 선택적으로 zeaxanthin만 생산하나요?
  A: zeaxanthin과 lutein의 전구체 경로가 나뉘는 지점인 LCYE 유전자를 제거하여 lutein 생합성을 차단했기 때문입니다.
• Q: TAP 배지란 무엇인가요?
  A: Tris-Acetate-Phosphate 배지로, Chlamydomonas 배양에 널리 사용되는 표준 혼합영양 배지입니다.
• Q: CRISPR-Cas9 RNP 시스템이란?
  A: DNA를 세포에 넣지 않고 단백질(RNP) 형태로 Cas9과 guide RNA를 투입하여 목표 유전자를 절단하는 방식입니다.
• Q: zeaxanthin은 왜 청색광을 차단하나요?
  A: zeaxanthin은 망막 중심에서 청색광 흡수 스펙트럼을 갖고 있어, 산화 스트레스로부터 시세포를 보호합니다.
• Q: mixotrophic 조건이란?
  A: 광합성뿐 아니라 외부 탄소원(예: 아세트산)을 함께 사용하는 배양 조건을 의미합니다.

용어 설명

• Zeaxanthin: β-carotene에서 유도되는 산소화된 카로티노이드로, 시세포 보호 기능을 가진 천연 색소
• Lutein: α-carotene 유도체이며, zeaxanthin과 함께 황반에 축적되는 주요 색소
• CRISPR-Cas9: 유전체를 정밀하게 절단하여 원하는 유전자를 제거하거나 교체할 수 있는 유전자 편집 도구
• RNP (Ribonucleoprotein): Cas9 단백질과 guide RNA가 결합된 복합체 형태로 유전자 편집 시 사용됨
• LCYE (Lycopene epsilon cyclase): lycopene을 α-carotene 방향으로 대사시키는 효소
• ZEP (Zeaxanthin epoxidase): zeaxanthin을 antheraxanthin으로 전환하는 효소로, 제거 시 zeaxanthin이 축적됨
• Carotenoid: 식물 및 조류에 존재하는 천연 색소군으로, 항산화 기능과 광보호 역할 수행
• Mixotrophy: 광합성과 외부 탄소원의 병행 사용을 통한 에너지 획득 방식
• Dry Cell Weight (DCW): 생체량을 측정할 때 사용하는 건조 상태의 세포 무게
• Southern Blot: DNA 샘플 내 특정 유전자 삽입 여부를 확인하는 분자생물학적 분석법